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尺寸排阻色譜法（SEC）原理
尺寸排阻色譜法（SEC）是根據(jù)樣品中分子量的大小進(jìn)行分離純化的，大分子量的物質(zhì)由于粒徑比填料的孔徑大，不能進(jìn)入填料腔體內(nèi)部，進(jìn)而被排除在外，中分子和小分子的粒徑比填料的孔徑小，可以順利的進(jìn)入填料的腔體內(nèi)部。而大分子不能進(jìn)入填料的內(nèi)部，畢竟快速的從填料之間的狹縫空隙中流出，最先流出色譜柱。而小分子物質(zhì)，進(jìn)入填料腔體，流動(dòng)的路線更長(zhǎng)，最遲流出色譜柱。大小分子量進(jìn)而得到分離。
在做多糖、糖蛋白、蛋白研究過程中，流動(dòng)相多數(shù)用水配置流動(dòng)相緩沖液，使用親水柱填料分離生物大分子，將SEC命名為凝膠滲透色譜。凝膠過濾色譜可作為用以分離生物活性物質(zhì)（通常等同于在多個(gè)純化步驟中其他的色譜技術(shù)）的前處理工具，或者亦可作為獲取溶質(zhì)分子信息的工具，包括分子大小或形狀、聚集狀態(tài)、生物聚合物與其配體結(jié)合的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。在過去凝膠滲透色譜多數(shù)采用葡聚糖、瓊脂糖或者聚丙烯酰胺等軟凝膠作為填料，而這些填料只能用于低壓制備，不能承受太大的壓力。而用于分析柱上的填料，多數(shù)是硬膠填料，單分散型，粒徑小，分辨率高?？梢猿惺軒渍着梁蛶资着恋膲毫Γ蚋叩膲毫?。
SEC色譜在糖分離過程的應(yīng)用
高聚多糖分子部分不能進(jìn)入親水填料的孔隙，并經(jīng)顆粒間的空隙流過，淋洗出來的順序在前；中聚多糖介于大體積分子和小分子之間；低聚寡糖和單糖體積較小的分子比凝膠顆粒的孔隙小，可以進(jìn)入凝膠顆粒的空隙，并在凝膠顆粒的孔隙以及顆粒之間的空隙不斷進(jìn)入出來擴(kuò)散，速度最慢，所以是最后被淋洗出來的。根據(jù)儀器的型號(hào)，實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相等條件，可以計(jì)算出保留時(shí)間或洗脫體積，可以根據(jù)普魯蘭標(biāo)品推測(cè)出分子量大小。分子量越大，其淋洗體積越小，保留時(shí)間越?。蛔恿吭叫∠疵擉w積越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。
BRT? SEC色譜柱是博睿糖推出的硅膠基質(zhì)的體積排阻系列色譜柱，其色譜填料為單分散、高純度、具有良好穩(wěn)定性的硅膠微球。硅膠的表面鍵合親水性聚合物。博睿糖采用特殊的表面修飾手段，確保了色譜柱具有良好的穩(wěn)定性和批次重現(xiàn)性。
不同規(guī)格BRT SEC固定相的特征參數(shù)（分析柱）
| 固定相 | SUGAR BRT-101 | SUGAR BRT-103 | SUGAR BRT-104 | SUGAR BRT-105 |
| 材料 | 納米親水鍵合材料 | 納米親水鍵合材料 | 納米親水鍵合材料 | 納米親水鍵合材料 |
| 粒徑 | 5μm | 5μm | 5μm | 5μm |
| 孔徑(?) | ~ 400 | ~ 600 | ~ 800 | ~ 1,000 |
| 直徑 | 4.6mm/7.8mm | 4.6mm/7.8mm | 4.6mm/7.8mm | 4.6mm/7.8mm |
| 長(zhǎng)度 | 300mm | 300mm | 300mm | 300mm |
| 多糖分子量范圍 | 1,000 - 24,000 | 11,000 - 280,000 | 48,000 - 410,000 | 400,000 - 5,000,000 |
| pH穩(wěn)定性 | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暫使用) | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暫使用) | 4 - 8.5 (pH 9.0 下可以短暫使用) | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暫使用) |
| 反壓(psi, 以4.6mm I.D.×300mm計(jì)) | ~ 700 | ~ 750 | ~ 750 | ~ 750 |
| 耐受壓力(psi) | ~3,500 | ~ 3,000 | ~ 3,000 | ~ 3,000 |
| 氯化鈉 | 50mM | 50mM | 50mM | 50mM |
| 耐受溫度(°C) | ~ 80 | ~ 80 | ~ 80 | ~ 80 |
不同規(guī)格SUGAR BRT 固定相的特征參數(shù)（制備柱）
| 固定相 | SUGAR BRT-101 | SUGAR BRT-103 | SUGAR BRT-104 | SUGAR BRT-105 |
| 材料 | 納米親水鍵合材料 | 納米親水鍵合材料 | 納米親水鍵合材料 | 納米親水鍵合材料 |
| 粒徑 | 10μm | 10μm | 10μm | 10μm |
| 孔徑(?) | ~ 400 | ~ 600 | ~ 800 | ~ 1,000 |
| 直徑 | 20mm | 20mm | 20mm | 20mm |
| 長(zhǎng)度 | 250mm | 250mm | 250mm | 250mm |
| 蛋白分子量范圍 | 1,000 - 24,000 | 11,000 - 280,000 | 48,000 - 410,000 | 60,000 - 5,000,000 |
| pH穩(wěn)定性 | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暫使用) | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暫使用) | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暫使用) | 4 - 7.5 (pH 9.0 下可以短暫使用) |
| 反壓(psi, 以4.6mm I.D.×300mm計(jì)) | ~ 700 | ~ 750 | ~ 750 | ~ 750 |
| 耐受壓力(psi) | ~3,500 | ~ 3,000 | ~ 3,000 | ~ 3,000 |
| 氯化鈉 | 50mM | 50mM | 50mM | 50mM |
| 耐受溫度(°C) | ~ 80 | ~ 80 | ~ 80 | ~ 80 |
Biomac SEC尺寸排阻色譜柱
| Biomacro SEC尺寸排阻色譜柱 | ||||
| 產(chǎn)品名稱 | SEC100 | SEC300 | SEC500 | SEC-WR |
| 官能團(tuán) | 醇羥基 | |||
| 基質(zhì) | 聚羥基甲基丙烯酸酯 | |||
| 粒徑 | 5um | |||
| 孔徑 | 100? | 300? | 500? | 100-500? |
| 直徑 | 4.6mm，8.0mm，20mm，50mm | |||
| 長(zhǎng)度 | 150mm，250mm，300mm | |||
| 耐壓上限 | 15Mpa | |||
| 溫度上限 | 80°C | |||
| PH范圍 | 2-12 | |||
| 線性范圍（葡聚糖） | 1000-10,000 | 5000-400,000 | 20000-3000,000 | 2000-3000,000 |
| 應(yīng)用領(lǐng)域 | 小分子化合物，低聚合物，多糖，糖蛋白，蛋白多糖，蛋白 | 小分子化合物，低聚合物，多糖，糖蛋白，蛋白多糖，蛋白 | 高分子聚合物，多糖，糖蛋白，蛋白多糖，蛋白 | 低聚合物，高聚多糖，糖蛋白，蛋白多糖，蛋白 |
寡糖系列色譜柱
| 寡糖色譜柱 | ||||
| 產(chǎn)品名稱 | BRT oligo A | |||
| 官能團(tuán) | 多層鍵合官能團(tuán) | |||
| 基質(zhì) | 硅膠 | |||
| 粒徑 | 8um | |||
| 孔徑 | 100? | |||
| 直徑 | 4.6mm，8.0mm，20mm，50mm | |||
| 長(zhǎng)度 | 150mm，250mm，300mm | |||
| 耐壓上限 | 15Mpa | |||
| 溫度上限 | 60°C | |||
| PH范圍 | 2-8 | |||
| 線性范圍（葡聚糖） | 180-1638 | |||
| 應(yīng)用領(lǐng)域 | 寡糖鑒定，寡糖分離 | |||
SUGRA BRT 系列色譜柱 多糖分子量校準(zhǔn)曲線
多糖分子量測(cè)定中串聯(lián)色譜柱 SUGAR BRT-105-103-101 (4.6mm I.D. x 250 mm)
多糖分子量測(cè)定中串聯(lián)色譜柱 SUGAR BRT-105-103-101 (8.0 mm I.D. x 300 mm)
多糖分子量測(cè)定中串聯(lián)色譜柱 SUGAR BRT-105-103-101 (8.0 mm I.D. x 300 mm)
多糖分子量測(cè)定中3根串聯(lián)色譜柱 Biomac SEC (8.0 mm I.D. x 300 mm)x3
多糖分子量測(cè)定中2根串聯(lián)色譜柱 Biomac SEC (8.0 mm I.D. x 300 mm)x2
寡糖分析色譜柱 BRT-oligo-A (8.0 mm I.D.x 300 mm)
1mL/min， 流動(dòng)相：水， 示差檢測(cè)器
分析柱規(guī)格：
BRT? SEC色譜柱使用注意事項(xiàng)：
1
分子量
可根據(jù)目標(biāo)物的分子量，來選擇合適規(guī)格的色譜柱。
2
樣品與流動(dòng)相
3
離子強(qiáng)度
色譜柱中不可避免會(huì)存在其他次級(jí)作用力，為了最大限度降低填料與被測(cè)物的次級(jí)作用力，必須調(diào)整流動(dòng)相的離子強(qiáng)度。NaCl是SEC分離中比較常用的鹽，可通過調(diào)整離子強(qiáng)度，減少次級(jí)作用力，進(jìn)而改善峰形和分離效果。
4
pH
流動(dòng)相的pH調(diào)整，更多也是為了減少色譜柱中的次級(jí)作用對(duì)被測(cè)物的影響，所以測(cè)定過程中需選擇合適的pH。為獲得最佳分離效果和延長(zhǎng)使用壽命，建議使用pH在4-7.5范圍內(nèi)的流動(dòng)相。
5
壓力
盡管BRT?SEC可在高至30Mpa 的壓力下使用，但正常的操作壓力應(yīng)當(dāng)?shù)陀?5Mpa。長(zhǎng)時(shí)間在高壓下運(yùn)行會(huì)損壞色譜柱和輸液泵。由于壓力來源于流速，因此最大流速將受制于系統(tǒng)所能承受的壓力。一般而言，柱壓會(huì)隨著色譜柱使用時(shí)間的增加而逐漸增加。
6
流速
盡量采用低流速測(cè)試，可以提高分離度，進(jìn)而獲得更好的測(cè)試效果。內(nèi)徑為4.6mm和8mm的色譜柱，一般建議其正常操作流速分別為0.1-0.4mL/min和0.1-1.5mL/min。
7
柱長(zhǎng)
通過增加色譜柱的長(zhǎng)度可以改善SEC分離度，所以在分離過程中，在一根色譜柱達(dá)不到分離效果時(shí)，可以考慮兩根或三根色譜柱串聯(lián)，甚至不同孔徑的色譜柱串聯(lián)（注：一般大孔徑的在前，小孔徑的在后）。這種條件下通常也會(huì)造成出峰時(shí)間延后，及系統(tǒng)壓力增加。
8
柱溫
最高操作溫度為80℃。為了獲得最長(zhǎng)的使用時(shí)間，最佳操作溫度為10-40℃。長(zhǎng)時(shí)間在高溫（>80℃）下操作也會(huì)損壞色譜柱，這種情形在高的 pH（>7.5）條件下尤其突出。
9
日常維護(hù)
隨著使用次數(shù)的增加，某些樣品可能吸附到入口篩板或填料上。當(dāng)積累到一定程度時(shí)會(huì)出現(xiàn)壓力升高，并伴隨峰形異常等現(xiàn)象。因此，日常使用過程中需要經(jīng)常注意對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗和維護(hù)，以達(dá)到最佳的分離效果和延長(zhǎng)使用壽命，定期更換保護(hù)柱和在線過濾器。
10
保存
如果長(zhǎng)時(shí)間不使用，用超純水作為流動(dòng)相，將柱子中的氯化鈉置換出來，1ml/min沖洗1h，然后用100%乙腈作為流動(dòng)相，1ml/min沖洗1h，然后封口保存。當(dāng)再次使用時(shí)，順序流動(dòng)相置換順序相反。乙腈的目的是防止色譜柱滋生細(xì)菌，延長(zhǎng)色譜柱使用壽命。
BRT? SEC色譜柱使用案例：
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[2] Y. Zhou, S. Wang, W. Feng, Z. Zhang, H. Li, Structural characterization and immunomodulatory activities of two polysaccharides from Rehmanniae Radix Praeparata, Int J Biol Macromol 186 (2021) 385-395.
[3] Y. Cao, L. Zou, W. Li, Y. Song, G. Zhao, Y. Hu, Dietary quinoa (Chenopodium quinoa Willd.) polysaccharides ameliorate high-fat diet-induced hyperlipidemia and modulate gut microbiota, Int J Biol Macromol 163 (2020) 55-65.
[4] T. Guo, Y. Yang, M. Gao, Y. Qu, X. Guo, Y. Liu, X. Cui, C. Wang, Lepidium meyenii Walpers polysaccharide and its cationic derivative re-educate tumor-associated macrophages for synergistic tumor immunotherapy, Carbohydr Polym 250 (2020) 116904.
[5] Y. Han, K. Ouyang, J. Li, X. Liu, Q. An, M. Zhao, S. Chen, X. Li, X. Ye, Z. Zhao, L. Cai, W. Wang, Sulfated modification, characterization, immunomodulatory activities and mechanism of the polysaccharides from Cyclocarya paliurus on dendritic cells, Int J Biol Macromol 159 (2020) 108-116.
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